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科研人如何正確制備細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)樣品
  • 更新日期:2023-03-31      瀏覽次數(shù):668
    • 細(xì)胞周期分析是分子生物學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)方法,尤其在抗腫瘤藥物研究上使用普遍。但細(xì)節(jié)若是處理不好,做得再多也做不出正確的、好看的分布圖。如何準(zhǔn)確制備細(xì)胞周期測(cè)試的樣品,科研實(shí)驗(yàn)行業(yè)的小伙伴們一起來了解下!




      先簡(jiǎn)單介紹下實(shí)驗(yàn)原理

      碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,可以與 DNA 和 RNA 結(jié)合,但其不能透過正常的細(xì)胞膜,所以對(duì)活細(xì)胞無染色作用??赏ㄟ^冷乙醇或其他破膜劑的作用,使細(xì)胞膜通透性增加。PI 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,選擇性地與核酸結(jié)合,RNase 裂解 RNA 后,細(xì)胞內(nèi)染料的熒光量與細(xì)胞核內(nèi)的 DNA 含量成正比。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度得到相對(duì) DNA 含量,根據(jù)各個(gè)時(shí)相 DNA 含量不同,將細(xì)胞分為不同的周期。

      具體操作流程及注意事項(xiàng)

      1、將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于 6 孔板中(2×105 個(gè) / 孔,根據(jù)細(xì)胞大小、增值速度適當(dāng)調(diào)整),每孔加 2 ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

      2、細(xì)胞貼壁后(根據(jù)細(xì)胞具體情況),去除培養(yǎng)基,分別加入培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 1 ml 孵育(不使用造成細(xì)胞大量死亡的藥物濃度和孵育時(shí)間)。

      3、藥物作用結(jié)束后,收集培養(yǎng)液,1500 rpm,離心 4 min。一定要一并收集漂浮的死細(xì)胞,不然會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果。

      4、消化收取貼壁細(xì)胞,吹打過程一應(yīng)要輕柔充分,避免細(xì)胞受損、細(xì)胞黏連;離心轉(zhuǎn)速為 2000 rpm,離心 4 min(離心轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm,也可以采用 1000 rpm,離心 5 min),PBS 洗 3 遍,以去除培養(yǎng)基、藥物殘留及細(xì)胞碎片。合并培養(yǎng)液和貼壁細(xì)胞。

      5、細(xì)胞沉淀中加入少量 PBS,輕柔充分重懸細(xì)胞。然后將重懸的細(xì)胞加入到 4℃ 預(yù)冷的 70% 冰乙醇中固定,輕輕吹打均勻(切記!??!不要將冰乙醇加入到細(xì)胞中,這樣會(huì)造成細(xì)胞黏連,嚴(yán)重影響結(jié)果),封口膜封口,4℃ 過夜。

      6、2000 rpm 離心 4 min,吸去固定液,PBS 洗兩次,以去除固定液。

      7、細(xì)胞中加入含 PI(50 μg/ml)、RNaseA(50 μg/ml,去除 RNA)和曲拉通(1%,通透細(xì)胞膜)的工作液 200 μl(曲拉通粘性大,配置時(shí)一定要渦旋,保證混合均勻),室溫避光孵育 30 min。按照步驟 1 中的鋪板細(xì)胞數(shù),這個(gè)體積的工作液可以保證測(cè)試時(shí)的細(xì)胞濃度正合適。

      8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。染色后,可以使用 PBS 去除染液,也可選擇不處理,親測(cè)沒有影響。

      9、FlowJo 軟件分析細(xì)胞周期時(shí)相分布。


      實(shí)驗(yàn)人注意!注意!!注意!??!

      整個(gè)過程一定要盡量降低操作對(duì)細(xì)胞的損傷,要吹打輕柔,減少離心次數(shù),轉(zhuǎn)速不要超過 2000 rpm。

      消化細(xì)胞時(shí)要保證細(xì)胞吹散,不要有細(xì)胞黏連,一旦這一步驟沒有消化充分,后面很難再將細(xì)胞吹散,后果嚴(yán)重。

      測(cè)試時(shí)細(xì)胞濃度一定要根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍,不然可能會(huì)影響準(zhǔn)確度。

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