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非 WHO 參考材料

百日咳博德特氏菌抗 FHA 血清（綿羊）

NIBSC 97/564

本材料不適用于體外診斷。

1. 預(yù)期用途

在綿羊中制備抗血清以純化百日咳博德特氏菌絲狀血凝素并用于無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗的對(duì)照測(cè)試。

2. 注意

該制劑不適用于人類食物鏈中的人類或動(dòng)物。

該材料不是人或牛來(lái)源。與所有生物來(lái)源的材料一樣，這種制劑應(yīng)被視為對(duì)健康有潛在危害。應(yīng)根據(jù)您自己實(shí)驗(yàn)室的安全程序使用和丟棄它。此類安全程序應(yīng)包括戴防護(hù)手套和避免產(chǎn)生氣溶膠。打開安瓿或小瓶時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎，以免割傷。

NIBSC 97/564 百日咳桿菌抗FHA血清(標(biāo)準(zhǔn)品)

3. 單元

沒有為該材料分配單元

4. 內(nèi)容

生物材料原產(chǎn)國(guó)：英國(guó)。

每個(gè)小瓶含有 1.0ml 0.01M 磷酸鉀 pH7.2、0.5M NaCl 溶液的凍干殘余物，該溶液含有通過(guò)用 50% 飽和硫酸銨沉淀抗百日咳桿菌 FHA 血清而純化的免疫球蛋白。

5. 存儲(chǔ)

未開封的小瓶應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C。

請(qǐng)注意：由于凍干材料固有的穩(wěn)定性，NIBSC 可能會(huì)在環(huán)境溫度下運(yùn)輸這些材料。

6. 開瓶指南

樣品瓶有一個(gè)“上翻式"圓形瓶蓋。無(wú)論是在瓶蓋上還是在小瓶的套環(huán)上，都標(biāo)有撬開瓶蓋的位置。這暴露了塞子的一個(gè)區(qū)域，通過(guò)該區(qū)域重構(gòu)可以使用皮下注射針頭和注射器提取制劑。如果首先 使用移液器，則使用鑷子等*取下金屬項(xiàng)圈，戴上合適的手套注意避免割傷。取下塞子以便進(jìn)入。應(yīng)注意防止內(nèi)容物丟失。

NIBSC 97/564 百日咳桿菌抗FHA血清(標(biāo)準(zhǔn)品)

7. 材料的使用

出于實(shí)用目的，每個(gè)小瓶都含有相同數(shù)量的抗血清。每個(gè)小瓶的全部?jī)?nèi)容物應(yīng)*重新懸浮在準(zhǔn)確測(cè)量量的水或緩沖溶液中。不應(yīng)試圖權(quán)衡其中的比例凍干粉。

如果不立即使用，建議將懸浮液儲(chǔ)存在 –20°C 或以下。應(yīng)避免反復(fù)凍融。小瓶不含抑菌劑，不應(yīng)假定制劑是無(wú)菌的。

用于綿羊免疫的抗原是純化的絲狀血凝素，它是由比利時(shí) Rixensart 的 SmithKline Beecham Pharmaceuticals 通過(guò) M Duchene 博士的斡旋慷慨捐贈(zèng)的。用弗氏*佐劑 (FCA) 乳化的磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 中的一劑 250µg 抗原 (PBS) 以 2ml 的總體積肌肉注射給綿羊，然后每隔 4 周注射三劑 150µg 抗原。最后一次注射后 2 周進(jìn)行終末放血。通過(guò)用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白來(lái)部分純化血清。

將沉淀物重新懸浮在PBS中并將懸浮液以1ml等分試樣分配到小瓶中并凍干。通過(guò)ELISA檢查抗血清對(duì)同源抗原的反應(yīng)性和與其他百日咳抗原的交叉反應(yīng)。在 1/10,000 的稀釋度下，抗血清給出了同源滴度，并且與其他百日咳抗原沒有交叉反應(yīng)。

酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb
二.甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。
三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。
四.異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）
五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。
七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。